DNA合成 | DNA侧序北京奥科生物技术有限责任公司

仪器型号	读取长度 (bp)	时间（工作日）	价格（￥ / 反应）
ABI 3730 xl	800	1-3	60
说明:1.未纯化PCR产物须收纯化费20元/样品;2.以上时间仅适合北京客户,外地样品须考虑运输时间.

2, 测序样品相关说明

样品类型	注意事项
细菌	1.通用载体或自己构建的载体,都请注明载体名称、抗生素类型以及具体测序引物. 2.我们提供Amp,Kan及Chl三种抗生素;特殊抗性、特殊培养条件的样品,请您提供已经培养好的5ml新鲜菌液或沉淀好的菌体. 3.如果是病毒(包括噬菌体)DNA,低拷贝质粒以及BAC DNA,请您纯化好模板直接用于测序. 4.建议您提供穿刺菌.如果是菌液则必须是新鲜的;加甘油后冷冻保存的菌株请您复苏后再提供. 5.样品太少会导致培养时间过长甚至出现培养细菌失败,以至延误您的实验,所以提供的菌液至少200ul以上. 6.务必注明是否有特殊结构: GC rich;GC cluster、Poly(A)、Poly(T)、重复序列及引物同源序列等.
质粒	1.为确保测序的成功率和质量,建议您尽量提供菌种测序. 2.因特殊原因只能提供质粒模板测序时,必须保证质粒是高纯度的,而且须溶解在灭菌的去离子水中而不是TE中.浓度大于100ng/ul,体积10ul以上,注明抽提方法. 3.如果是病毒(包括噬菌体)DNA,低拷贝质粒以及BAC DNA,请纯化好模板直接用于测序. 4.插入片段有特殊结构时必须注明,特别是含有通用引物的同源序列. 5. 务必注明是否有特殊结构: GC rich;GC cluster、Poly(A)、Poly(T)、重复序列及引物同源序列等.
PCR产物	1.原则上收取高质量的PCR原液，片段大小为200～1500bp。 2.取3ul原液电泳检测，为明亮单一条带。 3.提供未纯化产物测序，PCR原液不少于50ul；须注明产物的体积、片段大小、浓度，是否经过Agarose胶纯化。 4.提供已纯化的产物测序，体积不少于15ul，PCR产物须溶解在灭菌的去离子水中而不是TE中；注明提供PCR产物的体积、片段大小、浓度，是否经过Agarose胶纯化。 5.提供的测序引物，浓度不低于5pmol/ul(5umol/L),要求PAGE纯化，体积15ul以上，样品多将适当增加量。 6. 务必注明是否有特殊结构：GC rich;GC cluster、Poly(A)、Poly(T)、重复序列及引物同源序列等。
备注	1.奥科生物为您提供的免费通用测序引物信息请见附件二。 2.随机引物（RAPD）、含简并碱基或长度小于15的引物不适合用于测序。

3, 测序报告说明

1.提供报告的形式：
-- 结果出来的第一时间我们将用email 将序列发到您的信箱，随后送出测序报告。测序报告包括彩色图谱一份和相应序列文本。
-- 对于15个以下的测序，在提供书面报告的同时会提供一张软盘，里面包括Chromes软件、序列和图谱文件。
-- 大量测序的报告将采用光盘的形式提供结果，并附上一些最常用的序列分析软件。
2.查看测序报告方法：
-- 先阅Chromes软件及其补丁使用方法文档。
-- 运行Chromes补丁等程序（否则软件60天试用期过后，将只能打开图谱，而不能进行其他任何操作）.
3.特殊情况的说明:
-- 下列特殊情况下只发E-mail不提供测序报告（不收费）：
-- 应信号极弱甚至没有反应信号。
-- 信号极其杂乱，无法得到有用信息。
-- 由于DNA结构上的原因，有时会出现反应中途无法进行之情况。如：GC rich;G、C cluster;Poly(A)、Poly(T)的连续结构等。此外，另一种情况为反应中途出现套峰现象。此种情况一般为由于DNA结构中的重复序列，造成测序用引物和模板之间有二个以上的结合点。以上为由于DNA结构原因造成了无法正常进行DNA测序，对这种情况我们须按照正常反应收费。出现以上情况后我们提倡从另一个方向进行测序。
-- 如DNA本身或引物等的原因，测序反应从开始就无法进行，此时按反应失败计算。反应失败保证做第二次。如第二次同样情况失败。按标准收费的半价收费。

4, 常见问题解答

问：提供DNA测序样品时，提供何种形态比较好？
答：我们推荐客户提供菌体，由我们来提取质粒，这样DNA样品比较稳定。或是您在提供质粒的同时提供菌体。如果单纯提供质粒，一定要注意样品的纯度和数量。提供的测序样品为PCR产物时，特别要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。

问：提供的测序样品为菌体时，以什么形态提供最好？
答：菌体的形态大致包括：平板培养菌、穿刺培养菌、甘油保存菌等。我们建议您提供穿刺培养菌。因为平板培养菌运送时容易碎裂；而甘油保存菌则容易污染，运送过程中容易溢出。制作穿刺菌时，可在1.5ml的Tube管中加入琼脂培养基，把菌体用牙签穿刺于琼脂培养基（固体）中，37度培养一个晚上后便可使用。穿刺培养菌在常温下可保存数月，且不容易污染，便于运送。

问：在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么？
答：由于短片段DNA电泳后的信号较弱，一般在测序用引物后面几个至数十个（严重时40-50个）碱基会读不出来（或者读错）。请引起注意。

问：PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别？
答：众所周知，PCR扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了。因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存大着一些错配的序列，和PCR片段直接的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，可选用保真性能高的DNA聚合酶。

问：测序结果不到800 Base，还照常收费了，为什么？
答：如在DNA样品中的DNA序列分布匀称，没有复杂结构时，正常的测序反应能保证达到800Base以上。但有一些样品立体结构复杂，赞成聚合酶延伸反应终止。测序信号突然减弱或消失，或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由 DNA模板本身所造成（公司保证进行2次以上的测序工作）。对这些结果，公司须照常收费，出现这些情况的原因分析如下：
G、Crich 、G、C连续结构。这种情况一般表现为测序信号突然减弱或消失。
A、T的连续结构。这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰，根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，结构以后序列的聚合反应（打滑现象），造成测序结果紊乱，出现套峰。
一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢？现大还没有这方面的报道。根据我们的经验，这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰，但有时60-70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。
一般来说，PCR片段直接测序时，A或T的连续结构后面的序列的测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应（测序反应本身也是PCR反应）二次聚合酶的打滑的现象。
原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一个点开始聚合酶的聚合的反应便无法进行。

问：测序结果有很多套峰，还照常收费。为什么？
答-：DNA模板上出现二处以上的引物结合点，或者DNA模板上有严重的重复序列，以及测序引物不纯时，测序结果便会出现套峰现象，出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物本身造成，对这些结果（公司保证进行2次以上的测序工作）。公司须照常收费。

问：怎样使用TaKaRa提供的测序报告？
答-：在我们提供的测序报告中，有一份打印的或用邮件提供DNA碱基排列顺序的测序结果。这个结果是我们根据测序仪的自动分析，并经严格确认后打印的测序结果。但测序仪有时会发生误读或漏读现象，而我们的工作人员在检查时也没有发现。这时的打印结果或邮件提供会出现错误。只有测序的原始结果才是最原始的、最正确的，请客户拿到结果后，进行详细确认。如有不明白的地方，请立即和我们联系，我们会随时确认并进行解决。

问：怎样选择（设计）测序引物？
答-：测序用引物要求非常严格，不同于PCR产物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3′端的几个碱基能完全配对，既使引物长达80-100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。而测序引物便不一样了，必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Oligo5.0设计。在本公司测序时，我们可免费帮助设计测序用引物。
长度在15~25个碱基左右，一般选择20个碱基（根据GC含量作适当调整），3′端尽选择G或C碱基（但不绝对），以增加与模板的结合力。
T温度应选择50℃~70℃左右。
GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。
避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。
保证引物和模板100%配对，特别是3′端的几个碱基一定要100%配对。同时必须严格保证引物和模板只能有一个结合位点。

问：测序结果和文献资料不一样，为什么？
答-：原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序，那还有PCR产物错配的因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证是否和文献序列完全一致，请理解。